Kalibrační přímka

Kalibrační přímka vyjadřuje závislost absorbance na koncentraci látky v roztoku, přes nějž prochází monochromatické záření.

Metoda kalibrační přímky slouží ke kvantitativnímu hodnocení vzorku – k určení neznámé koncentrace látky ve vzorku. Funkčnost metody je založena na platnosti Lambert-Beerova zákona, z nějž snadnou úvahou odvodíme závislost absorbance roztoku na koncentraci absorbující složky v roztoku:

A – absorbance, ε (epsilon) - absorpční molární koeficient, c – koncentrace absorbující složky v roztoku, l – šířka vrstvy, přes kterou záření prochází, F – faktor, zahrnující experimentální podmínky měření

Kalibrační roztoky

Kalibrační roztoky, zvané též standardní roztoky nebo standardy, jsou odměrné roztoky látky, jejíž koncentraci chceme stanovit ve zkoumaném vzorku.

Nejčastější způsob přípravy těchto roztoků má dvě fáze: nejprve se připraví tzv. základní roztok z přesné navážky látky rozpuštěním na přesně známý objem, pak se odpipetují postupně se zvyšující objemy tohoto roztoku do tří až sedmi odměrných baněk a naředí se předepsaným rozpouštědlem na požadovaný objem.

Výpočet koncentrace základního roztoku je podle vztahu:

m – hmotnost látky v gramech, M – molární hmotnost látky v g/mol, V- objem roztoku v litrech

Koncentrace připravených kalibračních roztoků se vypočítá podle vztahu:

c₁ je koncentrace základního roztoku, V₁ je odpipetovaný objem základního roztoku, c₂ je výsledná koncentrace kalibračního roztoku, V₂ je výsledný objem kalibračního roztoku

Získané kalibrační roztoky mají rostoucí koncentraci, často velmi nízkou, proto lze výhodně použít odvozené jednotky – mmol/l.

Kalibrační přímka

Lineární závislost absorbance na koncentraci látky v roztoku popisuje přímka, jejíž směrnici určujeme experimentálně pomocí měření absorbance kalibračních roztoků. Vlnová délka záření je při měření konstantní, její hodnota se volí nejčastěji rovna vlnové délce, odpovídající absorpčnímu maximu látky -  zjistí se z absorpčního spektra látky.

Ze získaných experimentálních údajů lze závislost vyjádřit graficky (přímkou) nebo numericky (tabulkou). Čím vyšší počet kalibračních roztoků použijeme, tím přesněji se nám podaří závislost určit. Oběma způsoby určíme správnou koncentraci neznámého vzorku, výsledky se vzájemně mohou mírně lišit v závislosti na přesnosti metody provedení.

Obr. 1: Modelový příklad kalibrační přímky – grafické vyhodnocení experimentálních dat

Obr. 2: Numerické vyhodnocení experimentálních dat v tabulce

Pozn.: Je důležité si uvědomit, že výše uvedené způsoby vyhodnocení naměřených dat lze použít pouze v těch případech, kdy jsme si jistí lineární závislostí A na c, tzn. u roztoků, pro něž platí Lambert-Beerův zákon. V ostatních případech je nutné nejprve zjistit matematickou závislost A na c.

Metodou kalibrační přímky ve VIS oblasti lze určovat obsah pouze těch látek, které jsou v roztoku barevné nebo je lze chemickou reakcí zcela převést na barevné produkty. Například bezbarvou kyselinu salicylovou lze snadno převést na barevný komplex reakcí s železitými ionty. Vzniklý barevný produkt je však nestálý a po krátkém čase se opět rozkládá – tomuto faktu je nutné přizpůsobit provedení experimentu.

Obr. 3: Roztok kyseliny salicylové (vlevo) a roztok jejího komplexu s železitými ionty (vpravo)